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得此法不用愁,教你快速诊断猪蓝耳病

文章来源:http://www.aimeike.com.cn   时间: 2018-08-04 10:07:10   

  2017年2月份,铁岭市某猪场猪突然发病,1月龄以内的哺乳仔猪和断奶仔猪主要症状为体温升高达40 ℃以上,呼吸困难,采食量和饮水量都明显下降,有些仔猪眼睑水肿。育肥猪除了和仔猪有同样症状外还出现咳嗽、呼吸困难、双耳及腹部皮肤呈深紫色、眼部肿胀有结痂的症状;母猪主要症状为精神萎靡、嗜睡、食欲不振、体温升高;妊娠母猪则发生流产、早产、产死胎或木乃伊胎,还有产后无乳、胎衣不下等症状。剖检病死猪可见肺部呈暗红色,肝样变,肺小叶间质明显增宽,切面流出多量液体。此次发病死亡的猪主要是哺乳仔猪和断奶仔猪,育肥猪死亡较少,母猪未发生死亡。根据上述临床症状和剖检病变初步诊断患猪为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染。为了进一步确诊,采集了4头死亡仔猪的病料进行了实验室诊断,现报道如下。

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  材料

  1.1 病料

  4头发病仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结,采自铁岭市某猪场。

  1.2 主要试剂

  氯仿、异丙醇、无水乙醇,均购自沈阳农业大学国有资产管理处;TRIzol,购自Invitrogen公司;反转录试剂盒等,购自宝生物工程(大连)有限公司;DEPC水,购自索莱宝生物科技有限公司。

  1.3 主要仪器

  PCR 基因扩增仪,博日科技有限公司生产;4 ℃离心机,Thermo Fisher公司生产。

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  方法

  2.1 引物的设计与合成

  根据GenBank中PRRSV 的N 基因序列设计并合成了一对特异性引物。序列为:上游引物F 5′-TAAATATGCCAAATAACAAC-3′,下游引物R 5′-TAGGTGACTTAGAGGCACAGT-3′,扩增片段长度为430 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

  2.2 病料的处理

  将采集的猪肺脏和淋巴结剪碎,混合后放入用液氮预冷过的研钵中,加入1~2 mL 无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)研磨,制成组织悬液,然后将研碎的病料加到2 mL 的除酶离心管中,3 000 r/min 离心5 min,取上清液200 μL用于提取RNA。

  2.3 病毒RNA的提取

  向200 μL 的上清液中加入TRIzol 800 μL,充分振荡,冰上静置10 min;加入TRIzol体积1/5的氯仿溶液,充分振荡,冰上静置5 min;4 ℃、12 000 r/min离心10 min;然后缓慢取出,吸取上层水相400 μL,加到2 mL 离心管中,再加入等体积的异丙醇,颠倒剧烈振荡使其混匀;4 ℃ 静置20 min,然后12 000 r/min离心10 min;缓慢弃去上清液,加入与TRIzol等体积的用EDPC水配制的乙醇溶液,漩涡振荡,4 ℃、10 000 r/min离心5 min;弃去上清液,倒置5 min 后加入EDPC水20 μL ,测RNA 浓度并调整模板浓度为100 ng~1 μg。

  2.4 病毒RNA的反转录

  反转录体系中氯化镁(MgCl2) 4 μL,10×反转录Buffer 2 μL,RNase Free ddH2O 8 μL,dNTP Mixture 2 μL,反转录酶1 μL,随机引物1 μL,样本模板 2 μL,振荡均匀后进行如下程序:30 ℃保温10 min,42 ℃退火 15 min,95 ℃ 5 min使反转录酶失活,5 ℃保存5 min。

  2.5 PCR检测

  反应体系(10 μL):2×ES Taq Master Mix 5 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 3.2 μL。反应程序:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环;72 ℃终延伸2 min,4 ℃保温2 min。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中120 V电泳25 min。取出后在紫外凝胶成像仪中观察结果。将阳性PCR 产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定,然后进行BLAST比对。

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  结果与分析

  3.1 PCR 检测

  结果见图1。

  图1 PRRSV N基因片段扩增结果

  从图1看可见,在430 bp 处出现目的条带,与预期条带大小相符。

  3.2 BLAST 比对结果

  PCR产物序列测定结果与NCBI核酸数据库中PRRSV序列进行BLAST比对,结果与参考毒株(登录号为KX758249.1)相似率高达95%,说明本次猪场猪发病是由PRRSV引起的。

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  讨论

  目前检测PRRSV的方法有很多,其中RT-PCR法是一种高效、便捷、特异的方法。由于猪繁殖与呼吸综合征在临床症状和剖检变化上与某些疾病很相似,所以在诊断该病时仅依靠临床诊断是不够的,必须结合实验室诊断才能确诊。本次猪场发病后,在初步临床诊断基础上从发病猪场采集病料进行RT-PCR诊断,然后又进行了序列测定,最后确诊该猪场猪只发病是由PRRSV引起的。猪繁殖与呼吸综合征是一种常见的呼吸道疾病,多发生于夏季和秋季,发病快且发病率和死亡率高,传染源主要为发病猪或带毒猪,带毒猪的特点是可以向环境中持续排毒。该病还具有免疫抑制作用,易造成其他疾病的混合感染或继发感染。目前对该病的防控主要是采用疫苗接种的方法,由于PRRSV 容易发生变异,所以在疫苗的选择上要根据当地疫病流行情况选择恰当疫苗株接种。同时还要选择适当药物预防,防止细菌继发感染。

  作者 | 赵一霏 李 帅 沈国顺

  沈阳农业大学畜牧兽医学院

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